做过分子实验的人都知道，要想做的有效率有质量是很苦逼的，1个月做100个克隆那都是小case，没点看家的本事怎么行。如果再遇到比较极品的稀有基因，周旋个把月，那也是家常便饭。下面就和大家分享一些载体构建的经验，从此迈向科研达人：
1. 准备工作
俗话说：用欲善其事，必先利其器。建议大家在做构建之前先找好工具，效果事半功倍哦。推荐两个工具，一个是oligo软件，常用于引物设计和酶切位点分析；另一个是DNAstar软件，工具极强大，一款全面的生物医学软件，用作DNA和蛋白质序列分析、重叠群拼接和基因工程管理。
3. PCR扩增
如果没有现成的质粒可供酶切，PCR是最理想也是最方便的策略。目前市面上可选择的PCR酶实在太多，每隔一段时间还会升级，正常情况下，高保真的taq酶都能满足需求。但如果遇到难PCR的高GC基因，可以换不同PCR酶，添加一些 DMSO，甘油等，实在不行可以考虑Clontech的2 GC rich kit，价格和实力都大牛。另外，建议电泳切胶回收纯化PCR产物，去除一些非特异性条带。
4. 酶切
强烈推荐NEB的内切酶，记得有一次用别家的酶切过夜，结果质粒都被切碎了（当然当时质粒浓度也不高），而用NEB的酶，切个七十二小时仍旧一切OK，尤其现在NEB还推出了HF的内切酶，没有星活性而且统一都用Buffer4。另外TAKARA的酶也还可以。
6. 转化
按照SOP做就行，话说实验室原来从takara买感受态（competent cell），后来发现还是自己做的效率高（protocol免费索取）。要注意的是LB必须无菌而且没有抗生素，实验室原来有个技术员，做一次失败一次，我就奇怪了，后来才发现他用的居然是加了kana的LB，直接晕过去了。
7. 鉴定
想要快速鉴定，建议用菌液PCR，菌液PCR是有一定讲究的，很多人做菌液PCR鉴定假阳性特多，为什么？因为你PCR引物选的都在载体上，注意引物必须分别在载体和插入片段上才准，PCR方法鉴定是极其准确的，数百次菌液PCR经验。PCR鉴定做起来也很简单，拿个2mL tube，装0.5mL 加入相应抗生素的LB，摇个三小时左后取1uL做模板就行了。如果想更快，直接菌落PCR也不错，效果一样。
8. 测序
拿到测序结果时，不仅要核对序列，还要看测序峰图，这很重要。因为有时候光看序列对，实际上图显示的不对，或者虽然序列结果不对，但是图上出现的峰值本身就很怪异不可信，出现突变也不怕，有很大可能性是简并密码子；
还要重点检查的地方就是“接头”的地方，因为偶尔引物会出错，比方说少个碱基什么的，还有时候酶切之后连接也会丢一两个碱基什么的，如果不仔细检查到了后期悔之无及。
